Музей был образован весной 1920 года приказом Музейного отдела Наркомпроса в стенах упраздненного к тому времени Воскресенского Ново-Иерусалимского монастыря для хранения и пропаганды его архитектурного и художественного наследия. В 1921 году наряду с музеем историко-художественного профиля в стенах Ново-Иерусалимского ансамбля был создан еще один музей – краеведческий, а 20 апреля 1922 года оба музея были объединены. С этого времени музей стал формироваться в двух направлениях – историко-художественном и краеведческом. Сначала музей подчинялся Наркомпросу, а с 1925 года – МОНО (Московский отдел народного образования).
Первая экспозиция музея была открыта в Трапезных палатах Ново-Иерусалимского монастыря в 1925 году. В дальнейшем она расширялась и совершенствовалась. В 1935 году музей в Истре получил статус Московского областного краеведческого музея и под таким названием просуществовал до 1991 года. Он обладал богатейшими историческими и художественными коллекциями, обширной экспозицией (42 зала) и считался показательным для музеев своего региона.
В начале Великой Отечественной войны лишь часть музейного собрания удалось эвакуировать в Алма-Ату, часть экспонатов была спрятана в тайниках, оборудованных сотрудниками музея, но большинство экспонатов оставлено в залах. За две недели немецкой оккупации Истры, музей был разграблен захватчиками. 10 декабря 1941 года отступавшие фашисты взорвали ансамбль Ново-Иерусалимского монастыря. При взрывах погибли оставшиеся неразграбленными фонды музея. Так как Новый Иерусалим лежал в руинах, музей временно пришлось перенести в Москву. Факты взрыва Нового Иерусалима и разорения музея фигурировали на Нюрнбергском процессе.
В послевоенный период Новый Иерусалим (монастырский ансамбль и музей) возрождались буквально из руин. И первые успехи восстановления дали возможность музею вернуться из Москвы на прежнее место в Истру. Его основой стали возвращенные из эвакуации музейные коллекции, а также, все то, что удалось спасти от уничтожения. К 1959 году были завершены работы по созданию первой послевоенной экспозиции в залах 1-го этажа Трапезных палат. 1960-е- начало 1980-х годов стали временем подлинного возрождения музея, его фондов и экспозиций, собирательской работы, целью которой было не только восстановление утраченных коллекций, но и приобретение новых.
В настоящее время собрание музея насчитывает более 180 тысяч единиц хранения. Это коллекции археологических и этнографических материалов, письменных источников и фотодокументов, рукописей и редких книг, нумизматики, оружия, русских и зарубежных изобразительных материалов разных эпох (иконописи, шитья, живописи, графики, декоративно-прикладного искусства ХVI-ХХI вв. и т.п.). По содержанию коллекции отражают историческое и культурное развитие Московского региона, как одного из ключевых регионов России, начиная с его заселения и до наших дней. В музейное собрание входят и уникальные реликвии, напрямую связанные с историей Воскресенского Ново-Иерусалимского монастыря и личностью его основателя – шестого патриарха Московского и всея Руси Никона (1605-1681).
В 1991 году музей поменял профиль и стал Историко-архитектурным и художественным музеем «Новый Иерусалим». С 1994 года музей сосуществовал с возрожденным Ново-Иерусалимским монастырем. В 2009 году Правительством Московской области было принято решение о выводе музея с территории Ново-Иерусалимского монастыря. В связи с этим встала необходимость в строительстве нового здания для музея. Проект музейного комплекса был разработан архитектором Валерием Лукомским. Стилистика зеленой архитектуры была выбрана неслучайно, основой проектного решения нового здания стала идея сохранения доминирующей роли ансамбля Воскресенского Ново-Иерусалимского монастыря – памятника архитектуры XVII–XIX веков.
В 2014 году музей переехал в новое, трехэтажное здание, расположенное на участке площадью 4,28 га и построенное в непосредственной близости от монастыря на противоположном берегу Истры. Это создало большие возможности для масштабной выставочной деятельности. Музей был переименован в Музейно-выставочный комплекс Московской области «Новый Иерусалим».
С декабря 2017 года в музее открыта постоянная экспозиция «Новый Иерусалим—памятник истории и культуры XVII–XX веков», которая развернулась на площади 1500 кв. м. и рассказывает о том, как задумывался и складывался образ Святых мест в Подмосковье, о роли Воскресенского Ново-Иерусалимского монастыря как памятника русского зодчества, русской истории и культуры, о личности патриарха Никона.
